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引子

Hello小伙伴们寰宇好，我是生信手段树的小学徒”我才不吃蛋黄“。今天是胃癌单细胞数据集GSE163558复现系列第八期。第七期咱们使用AddModuleScore_UCell函数谋划细胞的增殖和迁徙评分。本期，咱们将使用monocle2进行拟时序分析。

1.配景先容

系列推文前七期，咱们共同学习了单细胞测序的基础分析，从第八期运转，咱们将不竭学习拟时序分析（Pseudo-Temporal Analysis），“Copykat”分析及细胞通信等高档分析。

疾病是一个动态变化的过程，在疾病发生发展的过程中，细胞状况随时代束缚变化。现存的单细胞测序本事提供的是某一时刻的“快照”，关联词通过拟时序分析，咱们不错推断出细胞的动态变化过程。

拟时序分析（Pseudo-Temporal Analysis）的界说如下：

拟时序分析（Pseudo-Temporal Analysis）是一种分析顺次，每每用于缱绻那些在时代上不连合的数据集。它试图通过模拟时代序列的形势来分析数据，即使数据自己并不是按照时代规定收罗的。这种分析顺次在多个规模齐有应用，比如在生物信息学中，它不错用于分析基因抒发数据，即使这些数据不是在连合的时代点上收罗的。拟时序分析的关键在于构建一个编造的时代轴，然后在这个时代轴上对数据进行排序和分析。这每每波及到以下几个设施：数据预措置：清洗数据，确保数据的质料和一致性。特征遴荐：识别和遴荐对分析灵验的特征或变量。时代轴构建：把柄数据的特质构建一个编造的时代轴，这可能基于生物学过程、实验假想或其他逻辑。排序：将数据按照编造时代轴进行排序。分析：使用时代序列分析的顺次来分析排序后的数据，比如趋势分析、周期性分析等。考证：通过交叉考证或其他顺次来考证分析服从的可靠性。*

单细胞拟时序分析的主要目的包括：

细胞发展轨迹推断：通过分析细胞状况的变化，推断细胞是如何从一种状况发展或分化到另一种状况。细胞状况排序：将细胞按照它们在假设的发展轨迹上的位置进行排序，即使这些细胞并非在连合的时代点上被不雅测。生物学过程清爽：识别细胞在特定生物学过程中的动态变化，如细胞分化、发育、疾病判辨等。关键基因和调控积累识别：发当今细胞状况改换中起关键作用的基因和调控积累。细胞异质性计议：揭示细胞群体里面的异质性，以及不同细胞亚群之间的关系。细胞侥幸计算：基于面前的细胞状况和拟时序轨迹，计算细胞可能的以前发展和分化侥幸。动态生物学过程建模：构建数学模子来模拟细胞状况的动态变化，为生物学假设提供定量刻画。疾病缱绻和调养靶点发现：在疾病缱绻中，拟时序分析不错匡助清爽病理状况下细胞的变化，发现潜在的调养靶点。发育过程的细胞谱系构建：在发育生物学中，拟时序分析有助于构建细胞谱系树，清爽细胞的发源和侥幸。实验假想拓荒：通过清爽细胞状况的变化，不错拓荒以前的实验假想，举例遴荐哪些细胞状况进行进一步的实验考证。

Monocle是面前最常用的拟时序分析算法，其中枢本事是一种机器学习算法——反向图形镶嵌(Reversed Graph Embedding)进行降维分析。Monocle2使用DDRtree进行降维分析，而Monocle3则使用UMAP降维，可视化细胞转录特征不异性关系，从而刻画细胞状况过渡轨迹。细胞状况过渡轨迹是“根”到“叶”的树状结构，细胞从根到达分支后，会遴荐一个分支往远方出动，终末到达叶子，每个细胞的psudotime值是它从叶复返根的距离。

monocle的分析经过与seurat肖似，准备输入文献，创建monocle对象cds(new cell data set),对数据预措置，筛选特定基因，降维，谋划psudotime值，终末可视化。本期使用monocle2进行拟时序分析。

2.数据分析2.1 导入数据

拆除系统环境变量，确立职责目次，加载R包，遴荐作念拟时序的亚群，读取恶性上皮细胞RDS文献：

rm(list=ls())getwd()setwd('')library(tidyverse)library(tinyarray)library(data.table) library(Seurat)library(ggplot2)library(clustree)library(cowplot)library(dplyr)library(monocle)sce.all = readRDS('malignant.rds')sce = sce.alltable(sce$celltype)Idents(sce) = sce$celltype

要是用我方电脑，细胞量太大，不错每个细胞亚群抽样 ：

allCells=names(Idents(sce))allType = levels(Idents(sce))# choose_Cells = unlist(lapply(allType, function(x){#   cgCells = allCells[Idents(sce)== x ]#   cg=sample(cgCells,10)#   cg# }))# cg_sce = sce[, allCells %in% choose_Cells]cg_sce = scetable(Idents(cg_sce))

2.2 数据准备

monocle构建CDS需要3个矩阵：

expr.matrixphenodata（pd）featuredata（fd）

expr.matrix：

Mono_tj<-cg_sceMono_matrix<-as(as.matrix(GetAssayData(Mono_tj,slot = "counts")), 'sparseMatrix')

构建featuredata:

一般需要两个col，一个是gene_id,一个是gene_short_name,row对应counts的rownames：

feature_ann<-data.frame(gene_id=rownames(Mono_matrix),gene_short_name=rownames(Mono_matrix))rownames(feature_ann)<-rownames(Mono_matrix)Mono_fd<-new("AnnotatedDataFrame", data = feature_ann)

构建phenodata：

Seurat object中的@meta.data一般会存放表型接洽的信息如cluster、sample的起原、group等，是以遴荐将metadata扶植为phenodata：

sample_ann<-Mono_tj@meta.datarownames(sample_ann)<-colnames(Mono_matrix)Mono_pd<-new("AnnotatedDataFrame", data =sample_ann)

2.3 monocle分析经过

构建new cell data set：

Mono.cds<-newCellDataSet(Mono_matrix,phenoData =Mono_pd,featureData =Mono_fd,expressionFamily=negbinomial.size())

newCellDataSet函数中，expressionFamily参数用于指定抒发矩阵的数据类型，有几个选项不错遴荐：寥落矩阵用negbinomial.size()；FPKM值用tobit()；logFPKM值用gaussianff()。

检讨phenodata、featuredata：

head(pData(Mono.cds))head(fData(Mono.cds))

Mono.cds十分于Seurat V5构建的Seurat对象，随后需要对数据预措置（揣摸模范因子、揣摸翻脸度）：

Mono.cds <- estimateSizeFactors(Mono.cds)Mono.cds <- estimateDispersions(Mono.cds)

筛选基因,这里不错把柄我方的需要筛选特定的基因：

disp_table <- dispersionTable(Mono.cds)unsup_clustering_genes <- subset(disp_table, mean_expression >= 0.1)Mono.cds <- setOrderingFilter(Mono.cds, unsup_clustering_genes$gene_id)

用DDRtree进行降维分析：

Mono.cds <- reduceDimension(  Mono.cds,  max_components = 2,  method = 'DDRTree')

谋划psudotime值：

Mono.cds <- orderCells(Mono.cds)head(pData(Mono.cds))

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2.4 monocle可视化

展示State轨迹散播图：

plot_cell_trajectory(Mono.cds,cell_size = 1)

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展示Cluster/Pseudotime轨迹散播图：

p1 = plot_cell_trajectory(Mono.cds,color_by="celltype", size=1,show_backbone=TRUE)p2 = plot_cell_trajectory(Mono.cds,color_by="Pseudotime", size=1,show_backbone=TRUE) p1+p2

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分面知道：

plot_cell_trajectory(Mono.cds, color_by = "celltype") + facet_wrap("~sample", nrow = 1)

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树形图：

plot_complex_cell_trajectory(Mono.cds,x=1,y=2,color_by="celltype")+  scale_color_manual(values =mycolors)+  theme(legend.title = element_blank())

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沿时代轴的细胞密度图：

library(ggpubr)df <- pData(Mono.cds)view(df)

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ggplot(df,aes(Pseudotime, colour = celltype, fill=celltype))+        geom_density(bw=0.5,size=1,alpha =0.5)+theme_classic2()

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Monocle基因可视化：

head(unsup_clustering_genes)s.genes <- c("NOC2L","PLEKHN1","HES4","ISG15")p1 <- plot_genes_jitter(Mono.cds[s.genes,],                        grouping = "State", color_by = "State")p2 <- plot_genes_violin(Mono.cds[s.genes,],                        grouping = "State", color_by = "State")p3 <- plot_genes_in_pseudotime(Mono.cds[s.genes,], color_by = "State")

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拟时接洽基因聚类热图：

#高变基因disp.genes <- subset(disp_table, mean_expression >= 0.5&dispersion_empirical >= 1*dispersion_fit)disp.genes <- as.character(disp.genes$gene_id)diff_test <- differentialGeneTest(Mono.cds[disp.genes,], cores = 4,                                   fullModelFormulaStr = "~sm.ns(Pseudotime)")sig_gene_names <- row.names(subset(diff_test, qval < 1e-50))plot_pseudotime_heatmap(Mono.cds[sig_gene_names,], num_clusters=4,                             show_rownames=T, return_heatmap=T)

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2.5 BEAM分析

由于细胞基因抒发步地不同,单细胞轨迹中每每包括分支。通过BEAM(Branched expression analysis modeling)分析，咱们可找到以依赖于分支的形势调控的基因。

disp_table <- dispersionTable(Mono.cds)disp.genes <- subset(disp_table, mean_expression >= 0.5&dispersion_empirical >= 1*dispersion_fit)disp.genes <- as.character(disp.genes$gene_id)mycds_sub <- Mono.cds[disp.genes,]plot_cell_trajectory(mycds_sub, color_by = "State")beam_res <- BEAM(mycds_sub, branch_point = 1, progenitor_method = "duplicate")beam_res <- beam_res[order(beam_res$qval),]beam_res <- beam_res[,c("gene_short_name", "pval", "qval")]mycds_sub_beam <- mycds_sub[row.names(subset(beam_res, qval < 1e-4)),]plot_genes_branched_heatmap(mycds_sub_beam,  branch_point = 1, num_clusters = 3, show_rownames = T)

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结语

本期，咱们投入了单细胞高档分析系列，使用monocle2进行了拟时序分析。下一期，把柄课程安排，咱们将暂时回到Bulk转录组，期骗TCGA-STAD数据进行生涯分析。干货满满，接待寰宇执续追更，谢谢！

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